Archivos Latinoamericanos de Producción Animal. 2024. 32 (2)

Protocolo para extracción de ADN a partir de sangre coagulada de aves 

Recibido: 2022­05­05. Revisado: 2023­08­06, Aceptado: 2024­06­25

1Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas: El Limón, Aragua, Venezuela

2 Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Maracay, Venezuela

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José Luis Arcia 

Resumen. La obtención de muestras constituye una de las principales limitaciones en estudios moleculares, debido a 
esto, se estandarizó un procedimiento no enzimático para la extracción y purificación de ADN genómico de forma 
económica y segura a partir de muestras de sangre coagulada. Se muestrearon 227 individuos de las razas de gallinas 
criollas  Venezolanas  IPA,  FAGRO  y  sus  respectivos  F

1    y  F2.    La  calidad  del  ADN  se  verificó  por  medio  de 

electroforesis  horizontal  en  un  gel  agarosa  al  0,8  %.  La  idoneidad  del  ADN  extraído  se  evaluó  mediante  la 
amplificación por PCR de los marcadores MCW0241 y LEI0122 a través de una electroforesis desnaturalizante en geles 
de  poliacrilamida  al  6  %.  La  concentración  y  pureza  de  los  aislados  de  ADN  se  determinó  mediante 
espectrofotometría  a  260  nm,  para  un  promedio  de  2.288,12  ng/µL  y  2,04  para  la  relación  A260/A280.  El 
procedimiento descrito permitió obtener ADN de buena calidad y en grandes cantidades de forma simple, confiable y 
económica.

https://doi.org/10.53588/alpa.320206 

Universidad Nacional Experimental Rómulo Gallegos, San Juan de los Morros, Guárico, Venezuela 

Alexis F. Marques U  

Protocol for DNA extraction from coagulated bird blood.

Abstract. Obtaining samples is one of the main limitations in molecular studies, because of this, a non­enzymatic 
procedure was standardized for the extraction and purification of genomic DNA in an economical and safe way 
from coagulated blood samples. A total of 227 individuals of the Venezuelan Creole hen breeds IPA, FAGRO and 
their respective F

1  and  F2  were  sampled.    DNA  quality  was  verified  by  horizontal  electrophoresis  in  a  0.8  agarose 

gel. The suitability of the extracted DNA was evaluated by PCR amplification of MCW0241 markers and LEI0122 
through denaturing electrophoresis in 6 % polyacrylamide gels. The concentration and purity of DNA isolates was 
determined by spectrophotometry at 260 nm, for an average of 2,288.12 ng/μL and 2.04 for the A260/A280 ratio. 
The  described  procedure  made  it  possible  to  obtain  DNA  of  good  quality  and  in  large  quantities  in  a  simple, 
reliable and economical way.

Key words: genetic techniques, genetic marker, PCR. 

Protocolo para extração de DNA de sangue coagulado de aves.

Resumo.  A  obtenção  de  amostras  é  uma  das  principais  limitações  em  estudos  moleculares,  por  isso,  um 
procedimento não enzimático foi padronizado para a extração e purificação do DNA genômico de forma econômica 
e  segura  a  partir  de  amostras  de  sangue  coagulado.  Foram  amostrados  227  indivíduos  das  raças  crioulas 
venezuelanas  IPA,  FAGRO  e  suas  respectivas  F

1  e  F2.    A  qualidade  do  DNA  foi  verificada  por  eletroforese 

horizontal  em  gel  de  agarose  0,8.  A  adequação  do  DNA  extraído  foi  avaliada  por  amplificação  por  PCR  dos 
marcadores MCW0241 e LEI0122 por eletroforese desnaturante em géis de poliacrilamida a 6%. A concentração e 
pureza dos isolados de DNA foram determinadas por espectrofotometria a 260 nm, para uma média de 2.288,12 ng/
μL e 2,04 para a relação A260/A280. O procedimento descrito possibilitou a obtenção de DNA de boa qualidade e 
em grandes quantidades de forma simples, confiável e econômica.

Palavras­chave: técnicas genéticas, marcadores genéticos, PCR.

Oscar De La Rosa1  

Rafael Galíndez González 2 

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Introducción

Arcia et al.

    El ADN constituye la materia prima fundamental en 
los  análisis  rutinarios  de  los  estudios  de  genética 
molecular y puede ser extraído de una gran variedad de 
fuentes biológicas, tales como tejidos, folículos, sangre e 
incluso  huesos  de  organismos  vivos  o  muertos  (ICMP, 
2021).  La  extracción  de  ADN  a  partir  de  sangre  tiene 
muchas ventajas, sin embargo, en algunos casos se hace 
necesario manejar gran cantidad de muestras las cuales 
deben  ser  preservadas  de  manera  adecuada  (ICMP, 
2021). En algunas ocasiones, la sangre se puede coagular 
debido a fallas en el proceso de conservación y/o por la 
presencia  de  factores  y  cofactores  de  coagulación 
(Martinuzzo, 2017), lo cual obligaría a repetir la toma de 
muestras  y  en  el  peor  de  los  casos,  puede  ocasionar  la 
pérdida definitiva del ADN. 
  
          Para  reducir  el  volumen  de  sangre  recogida  para 
pruebas  de  laboratorio,  algunos  autores  han 

desarrollado  metodologías  que  permiten  aislar  ADN  a 
partir de coágulos de sangre. Sin embargo, estas técnicas 
pueden ser difíciles o poco prácticas y puede requerir el 
uso  de  compuestos  altamente  tóxicos,  costosos 
instrumentos y equipos de laboratorio (ICMP, 2021). 

          La  coagulación  es  el  resultado  de  una  interacción 
coordinada  de  las  proteínas  sanguíneas,  las  células 
circulantes, células de la vasculatura y las proteínas de la 
matriz  extracelular  en  la  pared  de  los  vasos  (López, 
2016).  Las  muestras  de  sangre  provienen  de  aves,  las 
cuales  presentan  una  rápida  coagulación  (Babini,  et  al 
2022). El presente estudio consistió en estandarizar una 
técnica  no  enzimática  para  la  extracción  de  ADN 
genómico  de  forma  económica  y  segura,  a  partir  de 
sangre  coagulada,  que  pueda  ser  usado  para  realizar 
estudios de genética molecular 

    Las aves utilizadas en el estudio forman parte de las 
razas  de  gallinas  reproductoras  venezolanas  IPA  y 
FAGRO.  las  cuales  pertenecen  al  Laboratorio    Sección 
de  Aves  de  la  Facultad  de  Agronomía  de  la 
Universidad  Central  de  Venezuela,  municipio 
Girardot, Estado Aragua.

    Las  muestras  de  sangre  fueron  tomadas  de  33 
individuos de cada raza (66 en total), 95 individuos F1 
y  66  individuos  F2,  producto  del  cruzamiento  entre 
estas.    Las  muestras  sanguíneas  fueron  colectadas  en 
tubos  Vacutainer®  de  5  ml  y  conservadas  a  ­20  °C 
durante seis meses, después de los cuales se realizó la 
extracción  de  ADN.  Los  resultados  se  compararon 
contra  10  muestras  de  sangre  fresca  conservada  con 
EDTA, la cual fue procesada siguiendo el protocolo de 
extracción propuesto por De la Rosa et al. (2013). 

    Los  análisis  moleculares  se  realizaron  en  los 
Laboratorios  de  Biotecnología  Agrícola  del  INIA­
CENIAP  y  en  el  Centro  de  Investigación  de 
Biotecnología  Agrícola  (CIBA),  adscrito  a  la 
Coordinación  de  Investigación,  de  la  Facultad  de 
Agronomía, Universidad Central de Venezuela.

Aislamiento de ADN

    Usando una espátula (la espátula fue limpiada tres veces 
con una solución de 700 mL de etanol/L y 9 g/L de NaCl 
entre  muestras  para  evitar  la  contaminación  cruzada)  se 
tomaron fragmentos de coagulo de aproximadamente 250 
µL y se colocaron en tubos eppendorf de 1,5 mL. 

        Después  se  agregaron  400  µL  de  buffer  de  lisis  ce­
lular (10 mmol/L Tris­HCl, pH 8,0, 10 mmol/L KCl, 10 
mmol/L  MgCl

2,  2  mmol/L  EDTA,  pH  8,0;  0,4  mol/L 

NaCl  y  10  g/L  SDS),  se  agitó  por  inversión  y  dejó 
incubar hasta el día siguiente a temperatura ambiente. 
El EDTA aañadido al buffer de lisis celular, actúa como 
agente  quelante  de  cationes  metálicos  divalentes,  a 
objeto  de  inactivar  nucleasas  dependientes  de  Mg

2+  y 

Ca

2+ 

(metaloenzimas),  con  esto  se  inhibe  la 

degradación  de  los  ácidos  nucleicos  (Landázuri  et  al. 
2021; George y Brady, 2023).

    Las  proteínas  celulares  se  separaron  por  preci­
pitación,  después  de  la  adición  de  350  µL  de 
cloroformo:  isoamyl  alcohol  (24:1),  se  agitó  por  10 
segundos y se agregaron 350 µL de acetato de potasio 
5M  (agitando  por  10  segundos).  Después  de 
centrifugar  por  10  minutos  (14.000  g)  se  tomó  el 
sobrenadante y se transfirió a tubos nuevos. 

     El ADN se aisló por precipitación al añadir 700 µL 
de  isopropanol  frío  y  centrifugado  por  5  minutos 
(14.000  g),  para  después  descartar  el  sobrenadante.  El 
sedimento obtenido se lavó con 700 µL de etanol al 70 % 
y  se  centrifugó  por  5  minutos  (14.000  g),  se  descartó  el 
líquido  y  se  repitió  el  paso  anterior.  Posteriormente  se 
descartó el líquido y se secó 10 min a 45 0C y 8 min a  65 °C, 
finalmente se rehidrató con 20 – 25 µL de TE­1X.

     La concentración y pureza del ADN se verificó por 
espectrofotometría  a  260  nm  utilizando  un  NanoDrop 
modelo MD 2000 (Thermo Scientific). La integridad de 

Materiales y Métodos

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Extracción de ADN a partir de sangre coagulada de aves

las muestras de ADN se verificó mediante electroforesis 
en  gel  de  agarosa  al  0,8  %  previa  incorporación  de 
SYBER SAFE (DNA gel stain 10.000X) a razón de 2 µL/
100 mL de gel. 

    Asimismo, la idoneidad del ADN obtenido se evaluó 
mediante  amplificación  por  PCR  de  los  marcadores 
genéticos  moleculares  (Eurofins  MWG  Operon) 
MCW0241 (274 pb y 278 pb) y LEI0122 (306 pb y 310 pb) 
que en otros estudios han sido asociado con la madurez 
sexual  y  peso  del  huevo,  respectivamente  (Sasaki  et  al. 
2004; Goraga et al. 2011). 

      Los  productos  de  PCR  se  sometieron  a  electroforesis 
horizontal en gel de agarosa al 3 % (Scientific Trade Corp), 
utilizando  una  cámara  de  electroforesis  (Sigma  ­  Aldrich) 
de 60 mL. La fuente de poder se calibró a 65 voltios, 32 mA 
y 6 Watt, con una duración de 80 minutos. 

    Luego se realizó la electroforesis desnaturalizante en 
geles de poliacrilamida al 6 %, preparados con una relación 
19:1 (acrilamida / bisacrilamida). Las muestras se mezclaron 
con  5  µL  de  buffer  de  corrida  (azul  de  bromofenol/sigma 
114391­5G, glicerol/ sigma G7757 y agua destilada estéril), y 
después se desnaturalizaron (95 °C por 10 minutos) en un 
termo  ciclador  BIO­RAD  PTC­100,  posteriormente  se 
colocaron en un bloque frio con la finalidad de evitar que las 
hebras de ADN se volvieran a unir. 

    Una vez que la placa de la cámara para electroforesis 
alcanzó  una  temperatura  de  45  °C,  las  muestras  se 
cargaron en el gel a razón de 2 µL por pozo, usando un 
peine de 38 puestos. Se utilizaron 1,5 µL del marcador de 
peso  molecular  de  25  pb  (457  µg/mL,  Promega  D1501). 

Las  condiciones  de  la  cámara  fueron;  45  Wattios  y  2000 
voltios durante 90 minutos. Posteriormente las imágenes 
de  los  geles  se  visualizaron  primero  en  un  trans­
iluminador de luz blanca UPLAND modelo 91786, lo cual 
permitió  mediante  la  observación  directa,  discriminar  el 
genotipo  del  individuo  según  la  distancia  recorrida  y  el 
número de bandas de ADN presentes (aa; ab; bb). 

    Seguidamente se realizó la determinación de los pares 
de  bases  utilizando  un  digitalizador  de  imágenes  a 
través del programa UVITEC, UV Band tomando como 
referencia el marcador de peso molecular de 25 pb. 

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

    La  amplificación  de  los  fragmentos  de  los  QTL´s 
MCW0241  (sentido  5’­aaccagtttgttaacatcagc­3’  y  anti­
sentido  5’­  attggagttggtaccatacttc­3’)  y  LEI0122  (sentido 
5’­  aatccctatagaactttgtgc  ­3’¨y  anti  ­  sentido  5’­
gatcttactggattaccattc  ­3’)  se  llevó  a  cabo  en  un  equipo 
thermociclador  de  tiempo  final  (Thermo  Scientific).  El 
medio de reacción para la PCR (PROMEGA) se preparó 
para un volumen final de 20 µL por reacción siguiendo 
la siguiente formulación: 4 µL de Buffer (1X); 2,4 µL de 
MgCl

2 (25mMol); 0,6 µL de DNTP´s (10mMol); 0,5 µL de 

cada Oligo (10mMol); 0,12 µL de Polimerasa (5U/uL); 4 
µL de ADN (20 ng/µL) y 7,88 µL de H

2O.

    El  perfil  térmico  usado  para  la  amplificación  fue  el 
siguiente:  desnaturalización  inicial  de  94  ºC  (5  min),  30 
ciclos  de:  94  ºC  (1  min),  56,1  ºC  (MCW0241)  y  55,2  ºC 
(LEI0122) (20 seg), 72 ºC (25 seg) y extensión final de 72 
ºC  (7  min).  El  perfil  de  amplificación  se  realizó  en  un 
termociclador Bioer modelo GenePro.

Resultados y Discusión

    En la Figura 1 se puede apreciar la imagen obtenida 
después de la   electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %. 
En  la  mayoría  de  los  casos  se  observaron  bandas  de 
ADN  con  buena  integridad.  Por  otra  parte,  se  pudo 

observar  que  el  91  %  de  las  diluciones  mostraron  la 
presencia  de  bandas  de  amplificación  correspondientes 
a los QTL´s que se utilizaron en el estudio.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % de las muestras de ADN.

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    Las concentraciones de los aislados de ADN para las 
muestras de sangre coagulada oscilaron entre 211,7 ng/
µL  y  10.243,1  ng/µL  con  una  media  no  ponderada  de 
2.288,12 ng/µL. Estos valores superaron a los obtenidos 
en  este  mismo  estudio  para  las  muestras  de  sangre 
fresca donde se observó una concentración promedio de 
972,02 ng/µL (Cuadro 1). 

    Los  resultados  también  fueron  superiores  a  los 
observados  por  Saldaña  y  Hung  (2015)  y  Carvajal  et  al. 
(2021),  quienes  compararon  un  método  de  extracción 
usando un Kit comercial y el método de fenol­cloroformo 
y  reportaron  valores  promedios  de  9,10  ng/µL  para  el 
primer método y 232,47 ng/µL para el segundo.

Muestras

     Concentración de 

Relación 260/280

         ADN ng/µL

Sangre fresca

               972,02*

      1,26 ­ 1,97

Sangre coagulada              2288,12*

      1,74 ­ 2,04

Cuadro 1. Concentración y relación de pureza del ADN.

*: Promedios no ajustados

    Por otra parte, Saldaña et al. (2007) y Landázuri et al. 
(2021)  evaluaron  tres  métodos  enzimáticos  para  la 
extracción  de  ADN  a  partir  de  muestras  de  sangre  de 
bovinos 

utilizando 

solventes 

orgánicos 

(fenol, 

cloroformo  y  alcohol  isoamílico)  y  una  resina  quelante 
(Chelex 100) y obtuvieron valores de concentración que 
oscilaron entre 48 ng/µL y 224 ng/µL. 

    Evaluaciones hechas por otros investigadores usando 
distintos  procedimientos  para  la  extracción  de  ADN 
(enzimáticos,  mecánicos  y  químicos)  a  partir  de  sangre 
fresca  y  coagulada  de  diferentes  especies,  arrojaron 
valores  que  oscilaron  entre  5,8  µg  y  224  µg  con  un 
promedio no ponderado de 75,05 µg (Salazar et al., 1998; 
Riera et al., 2010; Monroy et al., 2014 y Chang et al., 2015)
El  nivel  de  pureza  (relación  A260/A280)  se  determinó 
mediante espectrofotometría y en este caso, osciló entre 
1,74  y  2,04,  valor  que  ubica  este  resultado  dentro  del 
rango de pureza óptima según los estándares de calidad 
para ADN establecidos por el Banco Nacional de ADN 
de la Universidad de Salamanca (BNA, 2020).   

  El  nivel  de  pureza  logrado  con  este  protocolo  es 
superior  al  reportado  por  otros  investigadores  para 
distintos  procedimientos  de  extracción,  los  cuales  se 

ubicaron entre 1,30 y 1,74 (Salazar et al., 1998; Saldaña et 
al., 2007; Riera et al., 2010; López y Mejía, 2012; Monroy et 
al.,  2014;  Chang  et  al.,  2015;  Saldaña  y  Hung,  2015; 
Salazar  et  al.,  2022)  y  demuestra  la  eficiencia  del 
protocolo para eliminar los restos de hemoglobina. 

Electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida.

    La idoneidad del ADN obtenido se validó mediante 
amplificación  por  PCR  de  los  marcadores  genéticos 
moleculares MCW0241 y LEI0122.  Los productos de la 
PCR  se  sometieron  primero  a  electroforesis  horizontal 
en  gel  agarosa  al  3  %  (Figura  3),  posteriormente  se 
realizó  una  segunda  PCR  y  en  este  caso  los 
amplificados  fueron  sometidos  a  una  electroforesis 
desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 6 %.

Figura  3.  Electroforesis  en  gel  de  agarosa  al  3  %  del 
marcador genético molecular MCW0241. 

    En la Figura 3 se pueden observar bandas de ADN 
con  buena  integridad  en  la  gran  mayoría  de  las 
muestras. La región de los QTL´s MCW0241 y LEI0122 
se  amplificaron  fácilmente  de  ambos  preparados  de 
ADN  y  no  se  observó  evidencia  de  contaminación 
cruzada  de  las  muestras.  Estos  resultados  evidencian 
que el ADN puede ser extraído de manera eficiente de 
muestras  de  sangre  liquida  o  coagulada,  incluso 
después de un almacenamiento prolongado. 

    Precisamente,  la  contaminación  con  ARN  o  la 
degradación  de  las  muestras  de  sangre  utilizando 
diversos  métodos  de  extracción  (resina  Chelex  o 
proteinasa  K)  ha  sido  reportado  por  Nuñez  et  al. 
(2021).  Por  tal  motivo,  los  hallazgos  de  este  trabajo 
demuestran la alta eficiencia del método utilizado, que 
a  la  postre  impactará  de  forma  positiva  al  obtener 
resultados precisos con insumos de bajo costo.

Conclusión

      La  técnica  estandarizada,  mostró  ser  eficiente  para 
procesar muestras de sangre coagulada (aún después de 
varios meses de congelación), siguiendo procedimientos 
rutinarios  que  no  exigen  una  cuantiosa  inversión  en 
materiales y equipos.

    El protocolo descrito permitió obtener ADN ideal para 
los  estudios  de  genética  molecular  y  mostró  eficiencia 
para evitar la contaminación con ARN o la degradación 
del ácido nucleico. La extracción se puede realizar a partir 
de sangre fresca o coagulada y el producto obtenido es de 
buena  calidad  y  en  grandes  cantidades.  La  metodología 
es simple, confiable y económica.

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Arcia et al.

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Agradecimientos:  Los  autores  manifiestan  su  agradecimiento  al  Instituto  de  Producción  Animal  (IPA)  de  la 
Universidad  Central  de  Venezuela  por  permitir  el  uso  de  los  ejemplares  de  la  sección  de  aves,  así  como  a  los 
Laboratorios de Biotecnología Agrícola del INIA­CENIAP y el Centro de Investigación de Biotecnología Agrícola 
(CIBA),  de  la    Universidad  Central  de  Venezuela,  por  el  apoyo  logístico  brindado  para  la  toma  de  muestras  y  la 
realización de los ensayos de laboratorio que permitieron la culminación de la presente experiencia.
Conflicto  de  intereses:  no  existe  ningún  tipo  de  conflicto  de  intereses,  ni  ninguna  relación  económica,  personal, 
política, ni académica que pueda influir. Por otra parte, no se han recibido ningún tipo de beneficio monetario, ni 
cualquier otro relacionado de alguna fuente, que pudiera tener interés en los resultados de esta investigación.
Aprobación del Comité de Experimentación Animal. El personal a cargo está calificado y siguieron las normas de 
cuidado y bienestar descritos en el Código de Bioética y Bioseguridad del Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e 
Innovación (FONACIT, 2008).
Contribuciones  de  los  autores:  Diseño  del  experimento,  producción,  cría  y  manejo  de  animales  experimentales, 
toma y manejo de muestras de sangre: José Luis Arcia, Rafael Galíndez. Análisis de Laboratorio de las muestras de 
sangre: José Luis Arcia, Alexis Márques, Oscar De La Rosa. Redacción: revisión y corrección de artículo: José Luis 
Arcia, Alexis Márques, Oscar De La Rosa, Rafael Galíndez.
Financiación: Universidad Central de Venezuela, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, propio.
Editado por: Julio Cesar de Souza

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